人結(jié)直腸癌細(xì)胞熒光素酶標(biāo)記 LOVO+LUC

細(xì)胞代號：LOVO+LUC

細(xì)胞培養(yǎng)條件：F12K+10%FBS+1%P/S   

細(xì)胞生長形態(tài)：貼壁生長

培養(yǎng)基中氣泡對細(xì)胞貼壁的影響

在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，普通手動(dòng)移液器加細(xì)胞液過程可能會(huì)由于操作速度過快造成氣泡產(chǎn)生，氣泡會(huì)破壞細(xì)胞附著，導(dǎo)致細(xì)胞培育的效果不佳，產(chǎn)生誤差，所以在移液時(shí)需要進(jìn)行練習(xí)，以避免氣泡生成，同時(shí)注意消除吸頭內(nèi)的空氣，最好是使用外置活塞式分液器，因?yàn)橥庵没钊椒忠浩骺梢栽诓划a(chǎn)生氣泡的情況下轉(zhuǎn)移易氣泡液體。

正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長良好，形態(tài)是否正常，有無污染，細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長狀態(tài)。

超凈工作臺內(nèi)的無菌工作規(guī)范

細(xì)胞培養(yǎng)是一項(xiàng)十分嚴(yán)謹(jǐn)且專業(yè)的實(shí)驗(yàn)過程，超凈工作臺原理是在特定的空間內(nèi)，室內(nèi)空氣經(jīng)預(yù)過濾器初濾，由小型離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱，再經(jīng)空氣高效過濾器二級過濾，從空氣高效過濾器出風(fēng)面吹出的潔凈氣流具有一定的、均勻的斷面風(fēng)速，可以排除工作區(qū)原來的空氣，將塵埃顆粒和生物顆粒帶走，以形成無菌的高潔凈的工作環(huán)境。所以實(shí)驗(yàn)一般在超凈無菌工作臺上進(jìn)行，所以超凈工作臺一定要保持整潔衛(wèi)生規(guī)范。超凈工作臺上應(yīng)該采用從左到右，從潔凈的實(shí)驗(yàn)空間到放置實(shí)驗(yàn)廢品的臟污空間擺放。

如果在實(shí)驗(yàn)過程中隨意擺放過多實(shí)驗(yàn)器材，容易阻擋超凈工作臺的氣道流通，形成湍流，容易使污染物進(jìn)入容器，讓細(xì)胞受到污染。

正確管理CO?培養(yǎng)箱

CO?培養(yǎng)箱是存儲(chǔ)細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)器材，實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)過程中難以避免需要擺放細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)CO?培養(yǎng)箱，這個(gè)時(shí)候就需要注意，實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)該避免頻繁的開關(guān)CO?培養(yǎng)箱，讓箱內(nèi)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境受到影響無法及時(shí)恢復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞培養(yǎng)生長受到干擾。同時(shí)，在CO?培養(yǎng)箱內(nèi)擺放的樣品需要注意規(guī)范好擺放的位置并做好正確的標(biāo)記，做到培養(yǎng)箱門快開快關(guān)，一般的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)箱往往多人合用，建議合用的培養(yǎng)箱配置內(nèi)外門，大化程度減少開關(guān)門對培養(yǎng)箱環(huán)境的影響，避免實(shí)驗(yàn)樣品混淆和交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)。

CO?培養(yǎng)箱的常規(guī)維護(hù)和消毒

CO?培養(yǎng)箱需要保持濕潤的環(huán)境，所以需要定期（1-2周）將盛液盤整體移出，將殘留的水清空，用70%的酒精或異丙醇溶液擦拭消毒，待干燥后添加無菌蒸餾水，再放回培養(yǎng)箱內(nèi)。

CO?培養(yǎng)箱一般需要1個(gè)月進(jìn)行一次消毒清理，實(shí)驗(yàn)人員需要按規(guī)范拆除培養(yǎng)箱的擱板、擱架及水盤，將酒精噴灑于布上，再進(jìn)行腔體的清潔，培養(yǎng)箱內(nèi)盡量避免死角的存在，擦拭腔體內(nèi)每個(gè)位置，再將移除的配件擦拭清潔后，安裝到位。

目前自動(dòng)化設(shè)備已代替人工復(fù)雜操作，可通過運(yùn)行高溫消毒程序，有效避免污染發(fā)生。

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細(xì)胞復(fù)蘇

細(xì)胞復(fù)蘇和凍存講究“慢凍快溶"，復(fù)蘇時(shí)一定要將凍存在液氮或-80℃中凝固的細(xì)胞凍存液快速融化至37℃，使胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對細(xì)胞造成損害。

復(fù)蘇準(zhǔn)備

?打開水浴鍋加熱至37℃。

? 超凈臺上放好離心管（一般15ml的），細(xì)胞培養(yǎng)瓶，移液管，紫外滅菌至少20至30分鐘，吹風(fēng)5至10分鐘除去臭氧。

?37℃預(yù)熱好要復(fù)蘇細(xì)胞的培養(yǎng)液，也可以不用預(yù)熱培養(yǎng)液，根據(jù)細(xì)胞情況選擇。

?向離心管中加約5至10ml培養(yǎng)液，從液氮罐或-80℃中取出凍存細(xì)胞，立即將凍存管放入37℃水浴中并輕輕搖動(dòng)，待融化后（約2min即可）立即將解凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含培養(yǎng)液的離心管中，800-1000rpm下離心5min，棄上清，加適量*培養(yǎng)液輕輕吹打重懸細(xì)胞后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕晃使瓶底液體分散均勻，標(biāo)好細(xì)胞名稱、代數(shù)、復(fù)蘇日期，顯微鏡下觀察后放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中。一般貼壁細(xì)胞過夜即可貼壁，換液和傳代時(shí)間根據(jù)不同細(xì)胞生長情況而定。

細(xì)胞復(fù)蘇注意事項(xiàng)

?復(fù)蘇時(shí)動(dòng)作要快，盡量減少胞內(nèi)形成冰晶，影響復(fù)蘇后細(xì)胞活率。

? 融化時(shí)盡量不要碰到管口，以免容易造成污染。

?若一次性需要復(fù)蘇細(xì)胞很多，可以分批水浴解凍，防止傳熱不佳使得細(xì)胞融化時(shí)間延長。

?若需要同時(shí)復(fù)蘇好幾種細(xì)胞，提前在離心管和培養(yǎng)瓶上做好標(biāo)記，或記住自己擺放的位置，不要弄混亂。

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