細胞名稱：人膽囊上皮細胞永生化+GFP

培養(yǎng)條件：上皮細胞培養(yǎng)體系  

生長狀態(tài)：貼壁生長

備注：原代細胞永生化，提供免疫熒光鑒定報告

人源 肺微血管內(nèi)皮細胞

人源 II型肺泡上皮細胞

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人源 肺成纖維細胞

人源 肺動脈內(nèi)皮細胞

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人源 心肌細胞

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人源 甲狀腺微血管內(nèi)皮細胞細胞培養(yǎng)問題----沉淀

當排除了污染后，細胞培養(yǎng)基的渾濁通?？梢越忉尀榻饘?、蛋白質(zhì)和其他培養(yǎng)基成分的沉淀。沉淀物可能對細胞健康有害，因為他們可能通過整合作用等過程去除營養(yǎng)物質(zhì)和其他需要的成分，從而改變培養(yǎng)基成分。

沉淀的原因

溫度變化

溫度是細胞培養(yǎng)中沉淀的主要原因之一。當暴露于端溫度變化時，高分子量的血漿蛋白會從溶液中沉降。熱失活和凍融循環(huán)會促進蛋白質(zhì)的變性和沉淀。由于液體或復溶培養(yǎng)基在每次使用之間保持冷藏狀態(tài)，鹽可能會沉淀出來，特別是10倍或其他濃縮液中析出。

失水引起的濃度變化

如果培養(yǎng)基存在蒸發(fā)，培養(yǎng)基組分（包括鹽）的濃度將增加。在培養(yǎng)基的表面特別容易形成晶體沉淀。

鈣鹽

在制備無血清培養(yǎng)基時，組分的添加順序可能會導致不溶性分子的形成。鈣鹽特別容易沉淀。例如，CaCl2和MgSO4在溶液中反應(yīng)形成CaSO4晶體。高壓滅菌和pH值不穩(wěn)定可能會加劇這一問題。

金屬元素補充劑

銅、鐵和鋅金屬元素是細胞生長所必需的，是無血清培養(yǎng)基的重要補充劑。其他血清成分的缺失可能會導致這些金屬在培養(yǎng)基中沉淀，產(chǎn)生一個對細胞有毒的環(huán)境。銅和鋅在氧化條件下更加容易沉淀。

污染

培養(yǎng)基渾濁可能是細菌或真菌污染造成的。

細胞培養(yǎng)中對沉淀的故障排除

溫度

有關(guān)培養(yǎng)基的最佳儲存和處理，應(yīng)參閱制造商指南。避免重復的凍融循環(huán)。

鈣鹽

在逐個加入其他培養(yǎng)基組分之前，先將CaCl2單獨溶解在去離子水中。

濕度

確保燒瓶和培養(yǎng)皿不存在蒸發(fā)。監(jiān)測培養(yǎng)箱的濕度，密封培養(yǎng)器皿，防止干燥。

其他金屬

加入鐵結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白可防止鐵在培養(yǎng)基中沉淀。

污染

丟棄被污染的細胞并對培養(yǎng)箱體進行消毒。遵循良好的實驗室措施以避免污染。

有目的的沉淀

盡管通常在細胞培養(yǎng)中不希望有沉淀，但是沉淀可以用作上清液中蛋白質(zhì)的純化策略。例如，硫酸銨沉淀法有時被稱為“鹽析"技術(shù)，用于從雜交瘤上清液或血清中純化抗體。

細胞培養(yǎng)做為生物學研究最基礎(chǔ)的技術(shù)之一，可以說是滲透科研界的方方面面。工欲善其事，必先利其器。細胞好不好，就看你懂不懂細胞培養(yǎng)的各種技術(shù)了。

?  原代培養(yǎng)

從原代組織中分離細胞的常用的方法是酶解法（胰蛋白酶和膠原酶）。

用無菌的解剖刀和剪子將組織剪成3~4mm小片，用平衡液（無鈣鎂離子）清洗組織碎片后去除上清液，并加入0.25%的胰蛋白酶（Trypsin，100mg組織加入1ml胰蛋白酶）或者膠原酶（Collagenase，50~200單位/ml），孵育4-18h。離心取上清后，用平衡液清洗幾次后，用*培養(yǎng)基懸浮細胞，進行培養(yǎng)。

?  傳代培養(yǎng)

依據(jù)細胞生長的特點，傳代方法有3種：

1. 懸浮生長細胞傳代（離心法）

將懸浮細胞離心（1000 rpm， 3 min）去上清，收集沉淀物加新培養(yǎng)基，混勻后進行傳代培養(yǎng)。

2. 半懸浮生長細胞傳代（直接吹打法）

3.此類細胞（如Hela細胞）部分貼壁，但黏貼不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁上脫落下來，進行傳代。

3. 貼壁生長細胞傳代（酶消化法）

去除瓶內(nèi)培養(yǎng)液后，加入1-2ml 0.25%的胰蛋白酶液（以消化液覆蓋整個瓶底為準）37℃靜置2-10min（顯微鏡下動態(tài)監(jiān)測）。移去蛋白酶液，加入培養(yǎng)液反復吹打瓶壁細胞，離心將細胞沉淀用培養(yǎng)液制成細胞懸液。吸取1/10—1/40細胞懸液，接種于含有適量新鮮培養(yǎng)液的新培養(yǎng)瓶中進行傳代培養(yǎng)。

     ......

細胞培養(yǎng)是一個不斷進步的過程，在平時做好積累，量變才會有質(zhì)變。

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