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  類器官是能夠在體外三維培養(yǎng)，并表現(xiàn)出相應(yīng)器官生物學(xué)特征的“最小系統(tǒng)"。隨著類器官培養(yǎng)技術(shù)的不斷進步，應(yīng)用也越來越廣泛。關(guān)于類器官構(gòu)建原理、培養(yǎng)等方面的問題解答，希望能夠?qū)Ω魑恍』锇橛兴鶐椭?/span>

基礎(chǔ)篇

Q1: 類器官培養(yǎng)對于起始細胞的來源有要求嗎？

A1: 目前培養(yǎng)的類器官主要來源于上皮細胞，對于非上皮細胞來源的類器官培養(yǎng)方式還需要進一步研究。

Q2: 類器官按照起始細胞的類型，分為幾種呢？

A2: 常見的類器官根據(jù)起始細胞的類型，可以分為兩種：

（1）腫瘤組織來源的腫瘤類器官；

（2）干細胞來源的類器官，包括：多能性干細胞 (PSC) /成體干細胞 (ASC)以及誘導(dǎo)多能干細胞(iPSC)。

Q3: 類器官是由單一種類細胞組成的嗎？

A3: 類器官并不是單一細胞組成的結(jié)構(gòu)，而是由具有干細胞性質(zhì)的起始細胞進行分裂和分化，并將多種類型的細胞自組裝的結(jié)構(gòu)，自組裝后的形態(tài)和功能與體內(nèi)相應(yīng)器官相似。

Q4：在沒有新鮮組織的情況下，可以用凍存組織提取的原代細胞進行3D培養(yǎng)嗎？

A4：可以的。已有學(xué)者驗證過，將人結(jié)腸癌、甲狀腺癌、肺癌、腎癌和肝癌的手術(shù)組織切碎后，以梯度降溫的方式進行冷凍，最終在液氮中保存15-18個月后進行復(fù)蘇和原代細胞提取，分別對細胞進行2D和3D培養(yǎng)，證實了凍存對于細胞活力和生長速度均無顯著影響^【1】。

當(dāng)然，由于組織來源不同、凍存條件不同，還需要大家根據(jù)實際情況進行驗證，新鮮組織提取的細胞依然是3D培養(yǎng)的選擇。

Q5：類器官可以像細胞一樣進行凍存和復(fù)蘇嗎？

A5：類器官可以凍存，通常會在傳代2-3次之后選擇凍存。為了達到最佳的效果，可以選擇類器官成熟（傳代7-10次）后再進行凍存。

Q6：類器官的尺寸需要進行控制嗎？

A6：是的，主要的原因是類器官內(nèi)部缺乏循環(huán)系統(tǒng)。

當(dāng)類器官的尺寸較大時，靠近中心的細胞難以和外界進行氧氣和營養(yǎng)成分的交換。因此這個結(jié)構(gòu)尺寸越大，死亡的細胞就越多（如圖1）^【2】。我們在培養(yǎng)的過程中，需要控制類器官的大小在4-5mm以內(nèi)。未來的類器官技術(shù)可以與血管類器官結(jié)合在一起，建立一個功能性的封閉循環(huán)系統(tǒng)，用以培養(yǎng)出更大尺寸的類器官。

圖1. TUNEL染色表明較大尺寸的類器官中心有大量細胞死亡（綠色），比例尺為100μm^【2】

Q7：類器官傳代的標準是什么？

A7：類器官的傳代通常是根據(jù)培養(yǎng)的時間判斷。一般在7-14天時進行第一次傳代，后續(xù)則每7-10天傳代一次^【3】。

Q8：類器官可以進行多少次傳代？

A8：大部分類器官可以在體外連續(xù)傳代10次（>6個月），甚至有些類器官可以連續(xù)傳代20次（>12個月）并且維持原有的生長速度^【4】。

Q9: 鑒定類器官的方法有哪些？

A9: 初步可以通過顯微鏡和H&E染色觀察形態(tài)；然后可以用Western Blot、qRT-PCR、免疫熒光、流式細胞術(shù)檢測該類器官是否表達相應(yīng)的biomarker；基因測序可以鑒定所培養(yǎng)的類器官是否有某些特征丟失；對于部分類器官，還可以檢測其是否具有功能，例如：已有研究檢測出胃類器官可以分泌胃酸，心臟類器官可以自主跳動。

Q10: 類器官是如何按照我們的意愿進行定向分化的？

A10: 在進行類器官培養(yǎng)前，我們需要了解該器官在體內(nèi)的發(fā)育過程，及早期發(fā)育相關(guān)的信號通路。

以胃類器官培養(yǎng)為例：胃由前后腸發(fā)育而來，早期發(fā)育需要由多種信號通路共同調(diào)控。那么在體外我們需要通過添加細胞因子的方式，指導(dǎo)激活/抑制相應(yīng)的信號通路，來達到相同的效果，如：PSCs在Activin A的作用下分化為內(nèi)胚層，Wnt3a、FGF-4和Noggin指導(dǎo)細胞向向前腸分化^【5】。

問：類器官原代培養(yǎng)的挺好的，一傳代就不行了是什么原因？

答：可能是傳代過程有樣本的丟失，因為基質(zhì)膠重選后還是會有一些類器官在膠里，傳代的時候可以不用把基質(zhì)膠wan全去除干凈，留一點。

問：除了T細胞，類器官還可以和哪些細胞共培養(yǎng)？

答：還可以和PBMC、成纖維細胞共培養(yǎng)

問：類器官復(fù)蘇的標準是什么？

答：類器官復(fù)蘇后，培養(yǎng)1周左右，可以正常進行傳代說明復(fù)蘇效果比較好。

問：類器官凍存的標準是什么呢？凍存需要多少類器官？

答：前5代建議是取2-3孔凍存為1管，1孔大概是20個類器官左右。

問：類器官鑒定的方法有哪些？

答：鑒定方式一是可以從組織層面進行，主要是組化鑒定；另外是分子層面，可以進行外顯子測序或者轉(zhuǎn)錄組測序等測序手段。

問：類器官培養(yǎng)成功的標準是什么呢？

答：目前還沒用一個統(tǒng)一的標準，一般類器官可以穩(wěn)定傳代3代以上，說明干性是比較好的。

問：類器官長到多大可以做藥篩呢？

答：一般傳代后長到200-300um可以進行藥篩實驗

問：一個類器官試劑盒 可以養(yǎng)多少個類器官？

答：2-4個，100ml的培養(yǎng)基可以養(yǎng)200個孔。

問：類器官可以直接用細胞系培養(yǎng)嗎?

答：用細胞系培養(yǎng)的不能成為類器官，只能稱之為細胞球。

問：取材時為什么剔除脂肪組織？脂肪肝可以做類器官培養(yǎng)嗎？

答：脂肪組織影響后續(xù)消化分離得到的干細胞純度，脂肪肝也是可以做類器官培養(yǎng)的，消化前可以多清洗幾次，去掉表面脂肪。

問 ：類器官培養(yǎng)一定需要基質(zhì)膠嗎？

答：基質(zhì)膠主要是為類器官提供支撐作用和營養(yǎng)物質(zhì)，基質(zhì)膠主要成分有l(wèi)aminin，collagen IV，heparan sulfate proteoglycans。

問：如果要做藥篩需要額外去除基質(zhì)膠和培養(yǎng)基嗎？

答：和傳代培養(yǎng)鋪板一樣，藥用培養(yǎng)基稀釋就可以。

問：類器官量多小的時候不需要加消化液？

答：一般是100um以下。

問： 想要CTC培養(yǎng)，需要多少樣本量呢？

答：至少50+個CTC，取樣時可以多取一些血，CTC細胞占比比較少。

問：原代培養(yǎng)中消化下來的細胞是只有干細胞嗎？

答：消化下來的細胞包含各個種類的細胞，但是能培養(yǎng)成類器官的只有成體干細胞和腫瘤干細胞，沒有干性的細胞在培養(yǎng)過程中不會增殖分化，養(yǎng)的過程會死掉。

問：初始量樣本量10*5，活性大于90%，可以培養(yǎng)出多少類器官？

答：培養(yǎng)一代，一般是24孔板的10個孔。

問： 類器官培養(yǎng)一代需要多長時間？

答 ：一般需要5-7天，長得快可3-5天。