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1、瘤細胞懸液接種

（1）無菌選取生長良好(有光澤，淡紅色)瘤組織或?qū)?shù)生長期培養(yǎng)瘤細胞。

（2）在PBS中將瘤組織剪碎后用勻漿器研磨，經(jīng)80～100目篩網(wǎng)過濾成細胞懸液。

（3）培養(yǎng)細胞應(yīng)用PBS洗兩遍。

（4）計數(shù)并調(diào)整細胞濃度至107～108／ml。

（5）常規(guī)消毒后，于接種部位(通常為背部或腋窩腹股溝皮下)用醫(yī)用注射器皮下潛行一段后注入細胞懸液(0.1ml／部位，＞106細胞)。初次接種成功率低，細胞數(shù)盡可能多一些。

（6）次日注意觀察動物一般情況。初次接種一般有一段較長的潛伏期，以后隨著傳代潛伏期逐漸縮短，最后固定為一個相對穩(wěn)定的時間。

2、腹水瘤的建立與腹水瘤的接種　將實體瘤細胞直接種于小鼠腹腔、腹壁或其他部位，引起腹水，腹水中含有瘤細胞，將這種腹水反復(fù)傳代，即可成為腹水瘤。初次傳代時，腹水常呈血性(含大量紅細胞)，反復(fù)傳代后腹水逐漸變成乳白色。腹水瘤的接種過程如下。

（1）將凍存或培養(yǎng)的腹水瘤細胞離心和洗滌，進行細胞計數(shù)。

（2）消毒動物，左下腹穿刺接種106腹水瘤細胞。

（3）接種腹水瘤細胞后約7~12d，待小鼠腹部明顯膨大。用碘酒棉球消毒小鼠腹部，用9號針頭抽取腹水，也可行腹部解剖后，用滴管吸取。每只小鼠可抽3~5ml。

（4）抽取的腹水經(jīng)3000rpm離心15min，收集上清，分裝凍存?zhèn)溆谩?/span>

1、凍存細胞：

（1）選對數(shù)增生期細胞(證明無支原體污染)，在凍存前1d換液。

（2）按常規(guī)方法把培養(yǎng)細胞制備成懸液，計數(shù)，使細胞密度達5×107／ml左右密度，離心，去上清。

（3）加入配制好的凍存液（培養(yǎng)液6.8ml，小牛血清2ml，DMSO 1ml，5.6%NaHCO3 0.1ml），按與去上清相同的量一滴一滴加入離心管中，然后用吸管輕輕吹打令細胞重懸。凍存細胞時培養(yǎng)液中加入保護劑10％二甲基亞砜(DMSO) 或甘油，可使冰點降低，使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外。

（4）分裝于無菌凍存管中，每管加1.5m懸液。

（5）旋好凍存管并仔細檢查，一定要蓋緊，做好標(biāo)記。

（6）凍存：在特殊的儀器或簡易的液氮容器中，按-1℃／min的速度，在30～40min時間內(nèi)，下降到液氮表面，再停30min后，直接投入液氮中。要適當(dāng)掌握下降冷凍速度，過快能影響細胞內(nèi)水分透出，太慢則促進冰晶形成。

操作時應(yīng)戴防護眼鏡和手套，以免液氮凍傷。

2、復(fù)蘇細胞：

（1）從罐中取出凍存管。

（2）迅速放入36℃～37℃水浴，不時搖動，使其急速融化，30～60s內(nèi)完成。

（3）凍存管用70％酒精擦拭消毒后，打開蓋子，用吸管將細胞懸液注入離心管中，再滴加10ml培養(yǎng)液。

（4）低速離心(500～1000r／min) 5min，去上清后再用培養(yǎng)液洗一次。

（5）用培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后，裝入培養(yǎng)瓶37℃培養(yǎng)，次日更換一次培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)。以后仍按常規(guī)進行培養(yǎng)。

凍存細胞數(shù)量要充分，密度應(yīng)達到107／ml，在融后稀釋20倍時，仍能保持5×105／ml數(shù)量。