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細胞培養(yǎng)常見問題匯總
更新時間:2022-04-20 點擊量:861

細胞培養(yǎng)常見問題匯總



新買或惠贈的細胞

1.新買的或惠贈的細胞如何處理?

不管買的細胞、惠贈的細胞,剛拿到手應(yīng)趕緊做這幾件事:檢測瓶子是否破裂;培養(yǎng)基是否漏出,是否渾濁;是否有支原體污染;迅速擴增凍存。


2.能否使用與原先培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基?

不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)基,細胞大都無法立即適應(yīng),造成細胞無法存活。


3.購買的細胞死亡或存活率不佳可能原因?

常見原因可能有:培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳;血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳;解凍過程錯誤;冷凍細胞解凍后,加以洗滌細胞和離心;懸浮細胞誤認為死細胞;培養(yǎng)溫度使用錯誤;培養(yǎng)箱氣體濃度達不到要求;細胞置于 –80 ℃ 太久。


復(fù)蘇凍存的細胞

4.收到的冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落的原因?

冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當,造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫,是因熱脹冷縮的物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時,均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。


5.冷凍管應(yīng)如何解凍?

將冷凍管由液氮桶中取出解凍時,必須注意安全,可佩戴防護眼鏡和手套預(yù)防冷凍管的爆裂。取出冷凍管后,須立即放入 37 ℃ 水浴環(huán)境中快速解凍,輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細胞造成損害。并注意水面不可超過冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。


6.細胞冷凍管解凍培養(yǎng)時,是否應(yīng)馬上去除 DMSO?

現(xiàn)在大多數(shù)實驗室會在解凍細胞后加培養(yǎng)液將DMSO除去,但也有研究者認為除少數(shù)特別注明對 DMSO 敏感的細胞外,絕大部分細胞株(包括懸浮性細胞),在解凍之后,可直接放入含有 10~15 ml 新鮮培養(yǎng)基的培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附的問題。


細胞培養(yǎng)用液

7.如何正確選擇培養(yǎng)基種類?

引用幾款比較經(jīng)典的培養(yǎng)基舉例:

圖片


8.如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基?

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細胞,很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長。總之,MEM 做粘附細胞培養(yǎng),RPMI-1640 做懸浮細胞培養(yǎng)是一個好的開始。


9.什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?

酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為 PH 值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。


10.細胞培養(yǎng)基的配制和儲存應(yīng)該注意什么?

細胞培養(yǎng)基配好后,要先抽取少許放入培養(yǎng)瓶內(nèi)在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)放置24~48h,已檢測培養(yǎng)液是否有污染,然后方可用于實驗。配置培養(yǎng)基所需的血清要合格并且保持穩(wěn)定。一個批號試用效果良好后,就可一次購入較多同一批號的血清,這樣實驗條件穩(wěn)定,配液時調(diào)整pH值較容易。每次配液量以使用兩周左右的量為宜,一次配液不要太多,一是短期內(nèi)用不完造成營養(yǎng)成分損失需要補充,二是量大易造成污染。


11.為何培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,顏色會偏紫色?

培養(yǎng)基保存于 4 ℃ 冰箱中,培養(yǎng)基內(nèi)的 CO2 會逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來越偏堿性,而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑 (通常為 phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏紫色。培養(yǎng)基偏堿的結(jié)果, 將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時,可以通入無菌過濾 CO2,以調(diào)整 pH 值。


12.什么情況下用到無血清培養(yǎng)基?

對于應(yīng)用培養(yǎng)細胞進行分離制備細胞生長因子、單克隆抗體等應(yīng)該選擇無血清培養(yǎng)基。


13.如何選擇正確的血清種類?

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14.可否使用與原先培養(yǎng)條件不同的血清種類?

不能。血清是細胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,所以血清的種類和品質(zhì)對于細胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。


15.血清滅活是否必須?

一般情況下不建議。熱滅活是以 56℃,30 分鐘來處理已解凍的血清,因為此加熱步驟,可以使補體去活化,而補體所參與的反應(yīng)有:溶細胞活性,平滑肌的收縮,肥大細胞和血小板組胺的釋放,增強吞噬作用,淋巴細胞、巨噬細胞的趨化和激活。

實驗顯示,經(jīng)過正確處理的熱滅活血清,對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進,或*沒有任何作用,甚至通常因為高溫處理影響了血清的質(zhì)量,而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清,沉淀物的形成會顯著的增多, 這些沉淀物在倒立顯微鏡下觀察,像是 "小黑點",常常會讓研究者 誤以為是血清遭受污染,而把血清放在 37C 環(huán)境中,又會使此沉淀 物更增多,使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。因此除了做免疫學(xué)相關(guān)實驗和培養(yǎng)一些特定細胞,如平滑肌細胞、胚胎干細胞等,不需要做熱滅活處理。


16.培養(yǎng)基中是否添加抗生素?

除特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。


17.何時更換培養(yǎng)基?

視細胞生長密度而定,或遵照細胞株基本數(shù)據(jù)上的更換時間,按時更換培養(yǎng)基即可。


細胞傳代

18.細胞傳代的方法都有哪些?

根據(jù)不同的細胞采取不同的方法。貼壁生長的細胞用消化法傳代;部分貼壁生長的細胞用直接吹打即可傳代;懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心分離后傳代,或用自然沉降法吸除上清后,再吹打。


19.原代培養(yǎng)的傳代應(yīng)注意的問題?

細胞沒有生長到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前,不要急于傳代;原代培養(yǎng)時細胞多為混雜生長,不同的細胞有不同的消化時間,因此要根據(jù)需要注意觀察及時處理,并根據(jù)不同細胞對胰蛋白酶的耐受時間而分離和純化所需要的細胞;

吹打細胞時動作要輕巧盡可能減少對細胞的損傷;傳代時細胞接種數(shù)量要多一些,使細胞能盡快適應(yīng)新環(huán)境而利于細胞生存和增值;隨消化分離而脫落的組織塊也可一并傳入新的培養(yǎng)瓶。


20.使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的?應(yīng)如何處理?

EDTA作用較胰蛋白酶緩和,主要作用在于能從組織生存環(huán)境中吸取Ca2+、Mg2+,這些離子是維持組織完整的重要因素。但EDTA單獨使用不能使細胞*分散,因而常與胰蛋白酶按不同比例混合使用,效果較好。常用比例為1:1或者2份EDTA:1份胰蛋白酶。EDTA的工作液濃度為0.02%,用不含Ca2+、Mg2+的BSS配置。如果使用EDTA,在終止消化前,需用緩沖液將消化液清除后才能加培養(yǎng)液。第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于 –20 ℃,避免反復(fù)冷凍解凍造成胰蛋白酶的活性降低,并可減少污染的機會。


21.欲將一般動物細胞離心下來,其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?

欲回收動物細胞,其離心速率一般為800~1000 rpm,5~10 分鐘,過高的轉(zhuǎn)速,將造成細胞死亡。


22.細胞的接種密度為何?

依照細胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長的重要原因之一。


23.細胞交叉污染的可能原因?

多種細胞系進行維持傳代操作時,各細胞系所需的器材和溶液沒有嚴格分開,往往會使一種細胞被另一種細胞污染。